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O sistema de micro HPLC 2D de alto desempenho permite realizar a separação de misturas
complexas de peptídeos com um alto nível de sensibilidade e resolução. Combinando
cromatografia de troca catiônica na primeira dimensão e cromatografia capilar de fase
reversa na segunda dimensão e utilizando 6 colunas trap, permite a otimização independente
das várias condições de separação. Desta forma, é possível a análise de grande quantidade
de traços de peptídeos de digeridos (digests), mostrando ser uma ferramenta extremamente
efetiva para a descoberta de proteínas desconhecidas com baixos níveis de expressão.
Acoplando o sistema com um espectrômetro de massa de alto desempenho com interface
de ionização por electrospray (ESI) é possível obter performance e sensibilidade inigualáveis.
Originalmente, o sistema de micro HPLC 2D da Shimadzu foi desenvolvido em colaboração
com o laboratório de neurotoxicologia do Instituto de Saúde Mental, Instituto Nacional
de Saúde, Estados Unidos.
1. Permite a análise de proteínas que não podem ser analisadas por eletroforese bidimensional
em gel;
. Proteínas altamente iônicas e hidrofóbicas podem ser analisadas on-line pelo sistema
micro HPLC 2D.
2. Permite a análise automática com alta resolução e sensibilidade de proteínas com
baixos níveis de expressão;
. Digeridos (digests) de proteínas podem ser automaticamente analisados, sendo possível
a análise de traços de peptídeos muitas vezes não detectados por eletroforese bidimensional
em gel.
3. Análise estável por meio de aprisionamento (trapping) on-line de amostra e dessalinização
automática seguida por RPHPLC;
. Uma amostra proveniente da coluna de troca catiônica é aprisionada em 6 colunas
mini trap (colunas de fase reversa com poder de retenção equivalente a C4) para dessalinização,
seguida de análise por fase reversa. A etapa de dessalinização evita problemas de
entupimento na coluna de fase reversa causada pela separação do sal. Desta forma,
o método permite análise precisa e estável.
A Fig. 1 mostra uma visão geral do procedimento de análise para o sistema. Cada etapa
do processo é realizada automaticamente, incluindo a injeção de amostras, separação
primária, aprisionamento (trapping) do eluato, dessalinização, separação secundária
e detecção por LC/MS.
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1. Proteínas digeridas enzimaticamente são introduzidas na coluna de troca catiônica
2. Os componentes são eluídos nas 6 colunas trap em ordem de concentração salina
3. Após a dessalinização on-line, os componentes são eluídos nas colunas de fase reversa
e a separação é realizada
4. O cromatograma (fase reversa) é obtido para cada fração
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Esquema
geral do procedimento de análise do sistema de micro HPLC 2D
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A Fig. 2 exibe a configuração do sistema de micro HPLC 2D totalmente automatizado.
Os peptídeos nas amostras injetadas pelo autosampler são eluídos em ordem da coluna
de troca catiônica enquanto a concentração de sulfato de amônio na fase móvel é aumentada
gradualmente. Em seguida, o eluato é aprisionado nas colunas trap. Após a dessalinização
destas colunas, os peptídeos são então eluídos para a coluna de fase reversa. Depois
da separação por fase reversa, a análise é realizada com LC-MS sem qualquer preparação.
Uma operação adicional de dessalinização previne a passagem de sais para a interface
LC/MS, garantindo análise estável durante longos períodos de operação do sistema.
Diagrama
do sistema de micro HPLC 2D
A Fig. 3 mostra o resultado de análise para uma digestão com tripsina de uma mistura
de 6 tipos de proteína (1 pmol cada). Para fins comparativos, o cromatograma superior
exibe os resultados de análise obtidos por LC/MS 1D, enquanto que a parte inferior
do gráfico exibe os resultados de análise obtidos por LC/MS 2D. O nível de resolução
para os peptídeos é melhorado utilizando este sistema.
O sulfato de amônio é utilizado para eluição na etapa primária; as concentrações para
cada digerido (digest) são 1mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM e 99 mM, respectivamente.
Os fluxos utilizados foram ajustados para 80 uL/min (diâmetro interno da coluna: 1mm)
e 10 uL/min (diâmetro interno da coluna: 300 um) na primeira e segunda dimensões,
respectivamente.
gráfico
superior: resultados obtidos por LC/MS 1D
gráfico
inferior: resultados obtidos por LC/MS 2D
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