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O seqüenciamento De novo é usado na elucidação da seqüência de peptídeos de um aminoácido
utilizando os dados MS/MS ou MSn sem o auxilio de um banco de dados. A abordagem experimental
envolve a digestão protéica, geralmente com tripsina, seleção do peptídeo de interesse
para MS/MS (utilizando um espectrômetro de massas Tandem), seguido por dissociação
por colisão induzida (CID) do peptídeo e posterior interpretação dos fragmentos resultantes,
a fim de determinar a seqüência peptídica.
Como a fragmentação de um peptídeo pode ser de certa forma previsível, as massas dos
íons fragmentos são usadas formar a seqüência peptídica. Como interpretação dos espectros
de massa Tandem pode ser demorada e trabalhosa, softwares têm sido desenvolvidos para
auxiliar este processo.
O SeqLab foi desenvolvido pela Shimadzu Corporation para dirigir o seqüenciamento
De novo e permitir ao usuário autonomia para:
. O seqüenciamento de peptídeos De Novo usando os dados de MS/MS e MS3;
. Usar predominantemente os dados obtidos no AXIMA Resonance e QIT, mas também poder
ser aplicados aos dados obtidos no AXIMA Performance.
Um conjunto de dados referentes a um espectro MS/MS é importado em um dos seguintes
formatos:
. Arquivos Mascot compreensivos (fornece informações úteis como fator de correlação
e fator S/R, que podem ser usadas para limitar o número de picos utilizados pelo Sequencer);
. Arquivos Mascot genéricos;
. Arquivos AXIMA Shimadzu.
SeqLab incorpora um filtro de picos chamado PreSeq que é empregado caso o processamento
de picos não ainda tenha sido aplicado. A qualidade dos picos listados usada na busca
afeta significativamente os resultados no seqüenciamento. O PreSeq filtra os ruídos
e exporta os dados processados do software Launchpad, fornecendo uma lista de picos
menor, na qual os íons fragmentos mais prováveis estão inclusos e outros excluídos.
O Preseq funciona do seguinte modo:
. Divide a lista de picos fornecida em grupos;
. O número de grupos é determinado pela massa do íon precursor;
. A largura do pico é determinada;
. O ruído médio é calculado com base no ruído de cada grupo;
. Finalmente os clusters de isótopos são encontrados e o pico monoisótopico é selecionado.
Os picos resultantes desta lista estão então prontos para o seqüenciamento utilizando
o software SeqLab. Informações adicionais tais como, enzima utilizada, tolerância
de massa e modificações podem ser incluídas para ajudar o cálculo. O SeqLab utiliza
este parâmetros para determinar a seqüência da cadeia peptídica, ou se a seqüência
completa não pode ser determinada devido à falta de íons fragmentos, uma seqüência
tag é fornecida assim como uma pontuação referente a confiança que se pode ter em
relação a seqüência sugerida. Seqüência sugeridas de peptídeos e seqüências tags podem
ser pesquisadas através do software SeqLab.
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Espectros MS3 podem fornecer resultados mais seguros |
O software SeqLab utiliza os espectros MS3 gerados no AXIMA Resonance ou QIT. Os dados
são encaixados aos de MS2 específicos para um íon precursor e um conjunto de dados
no formato de arvore é construído dentro do SeqLab. Incluir os dados de MS3 tem como
beneficio:
. Ampliar a faixa de massa para os dados do ion trap;
. Confirmar os resultados obtidos no modo MS2;
. Estender o seqüenciamento além dos resíduos de prolina.
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Apresentação dos resultados |
O SeqLab fornece ao usuário com uma série de janelas que permitem consulta aos dados
(Figura 1), que incluem:
. Arvore de dados;
. Lista de seqüência;
. Tabela com série de íons;
. Gráfico de seqüência;
. Gráfico de erro.
figura 1 - Janelas de interface do software SeqLab
A tabela de série de íons (Figura 2):
. Mostra os íons reais e teóricos utilizados para montar uma particular seqüência
de candidatos na lista de seqüências;
. Código de cores de acordo com os íons teóricos (pretos) ou observados a partir do
espectro (vermelho/verde);
. Mostra íons MS2 em vermelho;
. Mostra íons MS3 em verde.
figura 2 - Tabela de série de íons
O gráfico de erro (Figura 3):
. Mostra as diferenças de massa observadas entre os íons fragmentos candidatos e sues
valores teóricos calculados;
. Tipos particulares de íons (a,b,y) são agrupados por símbolos.
figura 3 - Janela do gráfico de erro
A janela do gráfico de seqüência (Figura 4):
. A seqüência deduzida é exibida em espectro;
. Selecionando uma seqüência na lista de seqüência ela é apresentada junto com a série
de íons.
figura 4 - Janela do gráfico de seqüência
O software SeqLab é compatível com o Windows XP, sendo stand-alone, pode ser executado
em qualquer PC, e não apenas no computador conectado ao instrumento. SeqLab foi desenvolvido
para melhorar a eficiência e utilidade do AXIMA Resonance, tornando-se um pacote atraente
para pesquisadores que pretendam explorar a estrutura e seqüência de amostras biológicas.
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